Первыми святыми, канонизированными Русской православной церковью, были князья Борис и Глеб, сыновья великого киевского князя Владимира, претерпевшие мученический подвиг непротивления врагам. В честь их на Руси было воздвигнуто много храмов и монастырей, создано большое количество икон и фресок с изображениями Бориса и Глеба. Не стал исключением и древний город Новогрудок.
Борисоглебская церковь была построена в 1517-1519 годах на месте старого деревянного храма XII века на средства Великого гетмана Литовского Константина Острожского. Она была четырехстолпной, трехаспидной. Стены ее были расписаны фресками, был выложен великолепный майоликовый пол. За долгие годы храм, изначально построенный из известняка, неоднократно перестраивался, переходил от одной конфессии к другой. В 1569 году храм был передан униатам. В начале XVII века при нем были основаны мужской и женский базилианские монастыри. В это же время здание церкви приобрело черты оборонительного сооружения, так как на пожертвования Александра Хрептовича были пристроены две оборонительные башни. В 1839 году церковь вновь стала православной, и вскоре после реконструкции ей стали свойственны черты псевдовизантийского стиля.
В 1924 году храм был снова реконструирован. В советские годы в здании размещался государственный архив. Храм был возвращен Православной Церкви в конце 1990-х годов XX века.
Борисоглебская церковь относится к охраняемым государством историческим и архитектурным объектам Беларуси.